Em formação

Por que podemos usar anticorpos produzidos por camundongos em tecidos de camundongos?


Tenho visto biólogos usarem anticorpos primários cultivados em camundongos em tecido de camundongos, e eles me disseram que, se o sangue for bem perfundido, não há problema com esse método. Como o anticorpo secundário (anti-camundongo) não se cola a todos os antígenos de camundongo do tecido?

Esclarecimento: Eu entendo que o anticorpo secundário é muito específico para todos os anticorpos primários de "classe" de camundongo. Posso perguntar então por que usar um anticorpo secundário de camundongo não reconhece anticorpos de fundo no tecido, aqueles que o camundongo produziu para si mesmo naturalmente antes de eu adicionar qualquer um dos meus anticorpos primários? Os níveis de anticorpos primários existentes já estão presentes no camundongo muito mais baixos do que os níveis do anticorpo primário que estou adicionando?


A razão pela qual o anticorpo secundário reconhece apenas o anticorpo primário é relativamente simples: ele é direcionado contra a parte Fc do anticorpo primário. Como esta parte é específica da espécie (mas constante entre todos os anticorpos de uma espécie, daí o nome constante), um anticorpo anti-camundongo secundário é direcionado contra todos os anticorpos de camundongo.

O princípio geral pode ser visto na figura (embora se trate de imunomarcação, o princípio permanece o mesmo, Imagem da Wikipedia):

O anti-rato secundário reconhece os anticorpos que estão presentes no tecido. Eles geralmente estão presentes em níveis baixos (a menos que você trabalhe com tecidos imunológicos como o baço) e apenas causam um fundo relativamente baixo. Se isso causar um problema, você pode tratar sua amostra antes de adicionar o primário com um bloco Fc que bloqueia os anticorpos presentes no tecido para que o anticorpo secundário não reconheça mais tarde.


Os anticorpos são muito específicos no que reconhecem (isso é chamado de epítopo, que é a pequena parte do antígeno que é reconhecida por um anticorpo específico), e os anticorpos secundários são feitos para se anexar a uma parte específica do anticorpo primário - você pode conseguir isso com ABs monoclonais. Os antígenos podem ser reconhecidos por muitos anticorpos (porque eles podem ter muitos epítopos para diferentes anticorpos), mas geralmente um único anticorpo reconhece apenas alguns ou mais provavelmente um único antígeno no máximo (uma vez que o epítopo específico ao qual ele se liga está presente apenas em alguns ou um único antígeno (s)).

A página wiki de anticorpos contém muitos detalhes sobre como funcionam os ABs.


Por que podemos conversar? Ratos 'humanizados' falam sobre o passado evolucionário

Ratos carregando uma "versão humanizada" de um gene que se acredita influenciar a fala e a linguagem podem não falar realmente, mas, mesmo assim, têm muito a dizer sobre nosso passado evolutivo, de acordo com um relatório publicado na edição de 29 de maio da revista. Célula, uma publicação da Cell Press.

"Na última década, percebemos que o camundongo é realmente semelhante aos humanos", disse Wolfgang Enard, do Instituto Max-Planck de Antropologia Evolucionária. "Os genes são essencialmente os mesmos e também funcionam de forma semelhante." Por causa disso, os cientistas aprenderam muito sobre a biologia das doenças humanas estudando ratos.

"Com este estudo, temos o primeiro vislumbre de que os ratos podem ser usados ​​para estudar não apenas doenças, mas também nossa própria história."

Enard disse que sua equipe está geralmente interessada nas diferenças genômicas que diferenciam os humanos de seus parentes primatas. Uma diferença importante entre humanos e chimpanzés que eles estudaram são duas substituições de aminoácidos no FOXP2. Essas mudanças foram corrigidas depois que a linhagem humana se separou dos chimpanzés e estudos anteriores forneceram evidências de que o gene passou por seleção positiva. Acredita-se que essa mudança evolutiva reflita a seleção de alguns aspectos importantes da fala e da linguagem.

"Mudanças no FOXP2 ocorreram ao longo da evolução humana e são os melhores candidatos para mudanças genéticas que podem explicar por que podemos falar", disse Enard. "O desafio é estudá-lo funcionalmente."

Por razões óbvias, os estudos genéticos necessários para resolver isso não podem ser concluídos em humanos ou chimpanzés, disse ele. No novo estudo, os pesquisadores introduziram essas substituições no gene FOXP2 de camundongos. Eles observam que a versão do gene do rato é essencialmente idêntica à dos chimpanzés, tornando-o um modelo razoável para a versão humana ancestral.

Camundongos com o FOXP2 humano mostram mudanças nos circuitos cerebrais que antes eram vinculados à fala humana, mostra a nova pesquisa. Curiosamente, os filhotes de camundongos geneticamente alterados também apresentam diferenças qualitativas nas vocalizações ultrassônicas que usam quando colocados fora do conforto do ninho de suas mães. Mas, diz Enard, não se sabe o suficiente sobre a comunicação do mouse para ler muito sobre o que exatamente essas mudanças podem significar.

Embora o FoxP2 seja ativo em muitos outros tecidos do corpo, a versão alterada não parecia ter outros efeitos nos camundongos, que pareciam ser geralmente saudáveis.

Essas diferenças oferecem uma janela para a evolução da capacidade de fala e linguagem no cérebro humano. Eles disseram que agora será importante explorar mais a base mecanicista dos efeitos do gene e sua possível relação com características que diferem entre humanos e macacos.

"Atualmente, só podemos especular sobre o papel que esses efeitos podem ter desempenhado durante a evolução humana", escreveram eles. "No entanto, uma vez que os pacientes que carregam um alelo FOXP2 não funcional mostram deficiências no tempo e sequenciamento dos movimentos orofaciais, uma possibilidade é que as substituições de aminoácidos no FOXP2 contribuíram para um maior ajuste fino do controle motor necessário para a articulação, ou seja, o único capacidade humana de aprender e coordenar os movimentos musculares nos pulmões, laringe, língua e lábios que são necessários para a fala. Estamos confiantes de que estudos combinados com camundongos, humanos e outros primatas acabarão por esclarecer se este é o caso. "

Fonte da história:

Materiais fornecidos por Cell Press. Nota: o conteúdo pode ser editado quanto ao estilo e comprimento.


Estratégias de bloqueio para IHC

Em princípio, qualquer proteína que não se ligue especificamente ao antígeno alvo ou aos anticorpos e outros reagentes de detecção no ensaio pode ser usada para o bloqueio. Na prática, entretanto, certas proteínas têm melhor desempenho do que outras, porque se ligam prontamente a locais não específicos (também chamados de locais reativos) em pH neutro ou estabilizam a função de outros componentes do ensaio. No entanto, nenhuma proteína ou mistura de proteínas funciona melhor para todos os experimentos de IHC, e o teste empírico é fundamental para obter os melhores resultados possíveis para uma determinada combinação de anticorpos específicos e outros reagentes de detecção. No exemplo abaixo, o tampão de bloqueio Thermo Scientific Blocker BSA foi usado em um experimento IHC fluorescente para detectar as proteínas de vimentina e lamina B1.


Detecção IHC fluorescente de vimentina e lamina B1 em tecido de cólon normal. As seções de tecido do cólon humano normal foram bloqueadas com tampão de bloqueio Blocker BSA (Cat. # 37520, 37525) antes da incubação com um antivimentina de camundongo (por exemplo, Cat. # MA5-14564) e anti-lamina de coelho B1 (por exemplo, Cat. # MA1-06103) anticorpos primários. Os anticorpos secundários usados ​​foram Invitrogen DyLight 405 - IgG de cabra anti-rato marcado (Cat. # 35501BID, sinal azul) ou DyLight 550 - IgG de cabra anti-coelho marcado (Cat. # 84541, sinal laranja rosado), respectivamente. Os núcleos celulares foram contrastados com verde (por exemplo, Cat. # S7572)

Procedimentos gerais de bloqueio

A etapa de bloqueio para IHC é mais frequentemente realizada após todas as outras etapas de preparação da amostra serem concluídas, mas imediatamente antes de incubar a amostra com o anticorpo primário. O protocolo geral é incubar a amostra de IHC fixada, incorporada, montada, seccionada, desparafinizada e não mascarada com o tampão de bloqueio apropriado por 30 minutos a durante a noite em temperatura ambiente ou 4 ° C com base em um protocolo otimizado específico para cada anticorpo e antígeno alvo. Lavagem suficiente após a etapa de bloqueio é geralmente realizada a fim de remover o excesso de proteína que pode impedir a detecção do antígeno alvo. No entanto, muitos pesquisadores não lavam após a etapa de bloqueio porque diluem seus anticorpos primários em seu tampão de bloqueio.


Por que os ratos são considerados excelentes modelos para humanos?

Humanos e camundongos não são parecidos, mas ambas as espécies são mamíferos e são biologicamente muito semelhantes.

Quase todos os genes em ratos compartilham funções com os genes em humanos. Isso significa que nos desenvolvemos da mesma maneira a partir do óvulo e do esperma e temos os mesmos tipos de órgãos (coração, cérebro, pulmões, rins, etc.), bem como sistemas circulatório, reprodutivo, digestivo, hormonal e nervoso semelhantes. Essas semelhanças possibilitam que os cientistas estudem a fisiologia dos camundongos para coletar informações sobre como os seres humanos crescem, desenvolvem doenças e envelhecem.

Essa semelhança genética também significa que camundongos e humanos herdam características da mesma maneira. Isso inclui traços físicos como a cor do cabelo (cor da pelagem em camundongos) e suscetibilidade a doenças como doenças cardíacas ou Alzheimer.

Como os ratos vivem vidas curtas em comparação com os humanos - cerca de dois anos em cuidados de laboratório, mas muito menos na natureza - é possível aprender muito sobre como as doenças crônicas progridem ao longo da vida e sobre os processos de envelhecimento. Os camundongos são pequenos e de manutenção relativamente econômica, o que os torna o modelo ideal de animal de laboratório.

Milhares de cepas de camundongos de laboratório estão agora disponíveis, então os cientistas podem escolher o modelo de camundongo ideal para estudar diferentes doenças e processos patológicos. E o genoma do camundongo é facilmente manipulado para criar modelos ainda mais precisos de doenças específicas.

Como os cientistas vêm estudando ratos de laboratório há mais de 100 anos, sabe-se mais sobre sua biologia e genética do que qualquer animal, exceto humanos. Este grande volume de dados, mantido e fornecido à comunidade científica mundial pelo Laboratório Jackson como Banco de Dados do Genoma do Mouse, torna o mouse o modelo de escolha para pesquisa biomédica.

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Biologia sintética trata da escassez global de antivenenos

Anticorpos produzidos em laboratório podem produzir tratamentos para picadas de cobra de alto volume e alta qualidade.

Quando a instituição de caridade médica Médecins Sans Frontières chamou a escassez mundial de antiveneno para cobras uma crise de saúde pública em setembro passado, o bioquímico brasileiro Paulo Lee Ho não se surpreendeu. Ele passou sua carreira no Instituto Butantan de São Paulo em busca de melhores maneiras de criar antiveneno para tratar picadas de cobras-coral.

Os métodos convencionais dependem do veneno natural da cobra coral, que é difícil de encontrar: as cobras produzem apenas pequenas quantidades a cada mordida e são difíceis de criar em cativeiro. Assim, Ho e outros se voltaram para a proteômica e a biologia sintética na esperança de melhorar a qualidade e a disponibilidade do antiveneno. “Precisamos de uma nova forma de atender a demanda por antiveneno do Ministério da Saúde”, afirma.

Esses esforços agora estão dando frutos. No mês passado, Ho e seus colegas relataram 1 que haviam projetado pequenos pedaços de DNA que, quando injetados em camundongos, desencadeavam anticorpos contra o veneno da cobra coral. Os cientistas então aumentaram a resposta imunológica dos animais, injetando-lhes pequenos pedaços de anticorpos de veneno sintético sintetizados em Escherichia coli bactérias.

Em um estudo separado também publicado no mês passado 2, outro grupo de pesquisadores no Brasil usou fragmentos de anticorpos sintéticos para neutralizar os efeitos de picadas de jararaca. Bothrops jararacussu.

Esse progresso é encorajador, dado o grave fardo médico causado por picadas de cobra no mundo em desenvolvimento, diz Robert Harrison, chefe da Unidade de Pesquisa de Veneno de Alistair Reid na Escola de Medicina Tropical de Liverpool, Reino Unido. A cada ano, cerca de 90.000 pessoas morrem após serem picadas por cobras venenosas 3.

No entanto, os antivenenos ainda são feitos usando um método que não mudou por mais de um século. Animais grandes, normalmente cavalos, são injetados com pequenas quantidades de proteínas purificadas extraídas do veneno de cobra, o que estimula a produção de anticorpos. O plasma contendo esses anticorpos é então administrado às vítimas de picadas de cobra.

Mas esse tratamento que salva vidas é limitado de maneiras importantes. Cada antiveneno é eficaz contra apenas uma única espécie ou, no máximo, um pequeno grupo. E os medicamentos devem ser refrigerados, um grande problema em países tropicais sem eletricidade confiável. “Quando você pensa sobre isso, é incrível que esses antivenenos funcionem”, diz Leslie Boyer, diretora do Venom, Imunochemistry, Pharmacology and Emergency Response Institute da University of Arizona em Tucson.

O número de empresas farmacêuticas que produzem antivenenos está diminuindo, porque os medicamentos não são muito lucrativos. Em 2010, por exemplo, a gigante farmacêutica Sanofi de Paris, encerrou a produção do antiveneno Fav-Afrique, que é projetado para tratar as picadas de dez das cobras mais venenosas da África.

Ho espera que sua abordagem ajude a preencher esse vazio. Em vez de depender do veneno extraído de cobras de coral vivas, ele começou com pequenos pedaços de DNA de cobra de coral que codificam as toxinas do veneno. Ele e seus colegas injetaram esses pedaços de DNA em camundongos para preparar seu sistema imunológico. Um mês depois, eles deram aos animais uma injeção de reforço contendo anticorpos de veneno sintético.

Apenas 60% dos ratos injetados com uma dose letal de veneno de cobra coral sobreviveram após receber o tratamento experimental de Ho, em comparação com quase 100% para os antivenenos existentes. Mas Ho não se intimida. “Esse resultado mostra que há outras formas de se obter anticorpos neutralizantes”, afirma. “Talvez para obter melhores resultados, precisamos tentar novamente, mas usar mais anticorpos. Nós simplesmente não sabemos ainda. ”

A segunda equipe brasileira, liderada pela bióloga molecular Carla Fernandes, do instituto de pesquisas biomédicas da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) de Porto Velho, testou uma técnica diferente, usando uma biblioteca de phage display para fazer versões sintéticas dos anticorpos que as lhamas produziam ao serem injetadas com B. jararacussu veneno de cobra. Dar esses anticorpos às vítimas de picadas de cobra eliminaria a necessidade de usar plasma animal. Também pode reduzir o dano muscular e a morte do tecido no local da picada, em comparação com os antivenenos tradicionais, porque os anticorpos sintéticos são menores e mais capazes de penetrar no tecido.

O caminho para os antivenenos mais recentes não é direto, mas os pesquisadores acreditam que mover-se rapidamente é a chave. “Houve um progresso rápido e significativo nessa área, mas precisa ser rápido. Há muitas pessoas morrendo de uma doença essencialmente evitável ”, diz Harrison.

Para Boyer, no entanto, a falta de antiveneno não é causada por falta de ciência. “Custa 14 dólares para fazer um frasco de antiveneno que custa US $ 14.000 nos Estados Unidos”, diz ela. “Você não vai ficar mais barato do que isso. As partes caras não são a ciência - é todo mundo querendo uma parte dos lucros que eleva o preço e o coloca fora de alcance. ”


Etapas envolvidas na tecnologia de hibridoma

A tecnologia de hibridoma é composta por diversos procedimentos técnicos, incluindo preparação de antígenos, imunização de animais, fusão celular, triagem de hibridoma e subclonagem, além de caracterização e produção de anticorpos específicos.

A geração de mAb pela abordagem de hibridoma requer conhecimento de várias disciplinas e prática de habilidades técnicas versáteis, que vão desde o manejo de animais, imunologia até biologia celular e molecular. A geração e identificação de clones de hibridoma de alta qualidade é um processo abrangente e trabalhoso e requer meses de trabalho durante o período de tempo desde a imunização até a identificação do hibridoma específico.


Fig 2. Geração de mAb pela tecnologia de hibridoma

1) Fusão celular

O polietilenoglicol (PEG) e a eletrofusão são comumente usados ​​para induzir a fusão celular na produção de hibridoma. O PEG funde as membranas plasmáticas de mieloma adjacente e / ou células secretoras de anticorpos, formando uma única célula com dois ou mais núcleos. Este heterocarionte retém esses núcleos até que as membranas nucleares se dissolvam antes da mitose. A eletrofusão une as membranas de células vizinhas pela aplicação de um campo elétrico pulsado. A eletrofusão é mais eficiente do que o PEG e os resultados são reproduzíveis.

2) Triagem de hibridoma

Mesmo nas fusões de hibridoma mais eficientes, apenas cerca de 1% das células iniciais são fundidas e apenas cerca de 1 em 10 5 formam híbridos viáveis. Isso deixa um grande número de células não fundidas ainda em cultura. As células do animal imunizado (células secretoras de anticorpos) não continuam a crescer na cultura de tecidos e, portanto, não confundem o trabalho posterior. No entanto, as células do mieloma são bem adaptadas à cultura de tecidos e devem ser mortas, o que pode ser conseguido pela seleção de drogas.

Normalmente, as células do mieloma têm uma enzima HGPRT defeituosa (hipoxantina-guanina fosforibosil transferase), bloqueando sua capacidade de usar a via de resgate. Estas células contendo uma proteína HGPRT não funcional morrerão em meio HAT. Apenas as células de hibridoma têm a capacidade de se dividir e proliferar no meio HAT porque o genoma do linfócito B torna-as HGPRT positivas e o genoma das células de mieloma pode se dividir indefinidamente.

3) produção de mAb

Os anticorpos de hibridoma podem ser produzidos in vitro e in vivo.

Para a produção de anticorpos monoclonais in vitro, os hibridomas são expandidos por transferência para placas de cultura de tecidos de 24 poços, seguido por um frasco de 25 cm 2 e um frasco de 75 cm 2 contendo meio adequado. A densidade celular é mantida entre 10 5 e 10 6 células / ml. Os sobrenadantes de cultura típicos rendem até 100μg / ml de anticorpo, a quantidade exata dependendo da densidade celular e da taxa de crescimento. A cultura in vitro fornece uma preparação de anticorpo mais pura. A Sino Biological pode oferecer um serviço de produção de hibridoma sem soro pelo uso de meio sem soro.

Para a produção de anticorpos monoclonais in vivo, os camundongos são preparados por injeção intraperitoneal com 10 5 - 10 7 células de hibridoma. A taxa de crescimento do tumor de ascite resultante é em geral muito variável e pode ser de menos de duas ou mais de cinco semanas. O líquido da ascite pode ser coletado de um camundongo anestesiado. É possível obter 10 ml de líquido ascítico ou mais de um camundongo com batidas regulares. O fluido da ascite será contaminado com imunoglobulinas de camundongo em pequena extensão e, se um anticorpo muito puro for necessário, isso pode ser inconveniente.


Por que os cientistas usam ratos em pesquisas médicas?

“O camundongo é o único mamífero que fornece um recurso tão rico de diversidade genética, juntamente com o potencial para manipulação extensiva do genoma, e é, portanto, uma aplicação poderosa para modelar doenças humanas. ”- Justice et al. (2011)

A pesquisa animal é um assunto emocional, inspirando um debate apaixonado de ambos os lados. Embora alguns achem desconfortável pensar nisso, é importante entender por que animais como ratos são usados ​​para a ciência médica.

Os ratos desempenham um papel especial e importante na pesquisa médica. Como os humanos, os ratos são mamíferos e seus corpos passam por muitos processos semelhantes, como envelhecimento, e têm respostas imunológicas semelhantes a infecções e doenças. Seus sistemas hormonais (endócrinos) também são muito parecidos com os nossos. Eles também são uma das primeiras espécies - junto com os humanos - a ter seu genoma completo sequenciado. Com isso, aprendemos que eles compartilham aproximadamente 80 por cento de seus genes conosco.

No mês passado, o Cientista do Centro de Inovação, Dr. Donald Branch, juntamente com o Dr. Anton Neschadim da Universidade de Toronto, publicou um novo modelo “Modelos de camundongos para destruição de plaquetas imunomediada ou trombocitopenia imunológica” em Protocolos Atuais.

Muitos avanços importantes na ciência médica vieram de estudos realizados em ratos. Isso inclui o tratamento para a leucemia promielocítica aguda - uma forma de câncer no sangue que afeta adultos jovens e agora é uma das formas mais tratáveis ​​da doença - bem como protocolos de transferência de genes para fibrose cística, que estão sendo testados atualmente.

Conquistas científicas ganhadoras do Nobel, como a descoberta da vitamina K, o desenvolvimento da vacina contra a poliomielite, a invenção da tecnologia de anticorpos monoclonais agora usada para o tratamento do câncer e a revelação de como os neurônios se comunicam no cérebro, tudo isso não teria ocorrido sem ratos.

  • O desenvolvimento de vacinas conjugadas de proteínas e testes em camundongos ajudaram a melhorar a meningite Hib (Haemophilus influenzae tipo b) vacinação para crianças pequenas.
  • Sem testes em camundongos para mostrar seu papel no bloqueio da ação do hormônio, o medicamento tamoxifeno não estaria disponível para mulheres como tratamento e prevenção contra o câncer de mama.
  • Pesquisas recentes em ratos portadores de um sistema imunológico humanizado descobriram novos alvos potenciais para uma nova vacina contra a tuberculose.

Por que os animais ainda são usados ​​para pesquisas clínicas?

Embora os avanços na tecnologia de laboratório ofereçam alternativas como cultura de células e organoides (mini-agrupamentos 3D de células que se comportam como órgãos minúsculos) para pesquisas clínicas, os cientistas ainda obtêm muitas informações valiosas trabalhando com animais de laboratório, como ratos.

O que acontece em um corpo vivo não pode ser investigado usando um prato de células, por exemplo. Freqüentemente, a doença envolve mais do que apenas um único órgão e, para testar novos medicamentos, devemos examinar o corpo inteiro para ver como ele responde à terapia.

Os pesquisadores usam muitos outros sistemas para investigação clínica - como cultura de células, explantes, esferóides, modelagem in silico e cultura de órgãos - mas um camundongo oferece o que essas alternativas não podem: um organismo vivo inteiro para investigar doenças, resposta ao tratamento, desenvolvimento de câncer e outras questões básicas de pesquisa.

Por que ratos? Fisiologia

A fisiologia e o tamanho dos ratos - eles são pequenos o suficiente para serem manuseados e alojados facilmente - são os principais motivos de sua popularidade no laboratório. Em 2013, os laboratórios no Canadá usaram pouco mais de 1,2 milhão de camundongos em pesquisas de acordo com o Conselho Canadense de Cuidado dos Animais, o órgão nacional que supervisiona os regulamentos rígidos em torno da saúde e do bem-estar de todas as espécies de laboratório.
(CAC Animal Data Report 2013)

Fisiologicamente, os ratos são muito parecidos com os humanos, embora cerca de 3.000 vezes menores (Partridge, 2013), mas com funções corporais básicas semelhantes, como produção de células sanguíneas (hematopoiese), digestão, respiração e sistema cardiovascular. Embora existam diferenças, os ratos respondem de forma semelhante aos humanos quando estão doentes ou são submetidos a tratamento.

Por exemplo, por meio do trabalho em camundongos, os pesquisadores recentemente fizeram avanços no tratamento da trombocitopenia imunomediada de doenças do sangue, uma doença auto-imune em que o corpo produz anticorpos que direcionam as plaquetas para destruição antes que possam ser usados ​​para a coagulação do sangue (Neschadim and Branch, 2015 Yu et al. 2015). Em outro estudo, testes em camundongos com outro tipo de distúrbio de coagulação mostraram como as proteínas em uma transfusão de plasma restauram a função de coagulação e param o sangramento (Eltringham-Smith et al., 2015).

“Modelos de camundongos de várias doenças humanas, incluindo trombocitopenia imune, têm sido relativamente fáceis de desenvolver, uma vez que a fisiologia e o metabolismo dos camundongos se assemelham aos dos humanos. Esses modelos foram extremamente valiosos para mim e minha equipe na investigação do ITP. Sem eles, não estaríamos tão avançados em nossas pesquisas, em busca de medicamentos que pudessem ajudar a melhorar a qualidade de vida de muitos pacientes. Acabamos de publicar métodos detalhados sobre como configurar e usar modelos de mouse para ITP. Um modelo, nosso modelo de camundongo com escalonamento de dose, se assemelha mais ao ITP humano do que a maioria dos outros modelos atualmente em uso pelos investigadores. "

- Dr. Donald R. Branch, PhD, cientista, Center for Innovation, Canadian Blood Services

Por que ratos? Diversidade de reprodução e espécies

Os camundongos também se reproduzem facilmente, com gestações curtas e ninhadas grandes, que são importantes para ajudar os pesquisadores a criar seus próprios camundongos modificados. No entanto, a maioria dos laboratórios no Canadá compra ratos não especializados de criadores comerciais, recebendo animais criados para fins específicos com um histórico completo de reprodução. Para os pesquisadores, isso é muito importante: trabalhar com animais que apresentam pouquíssima diferença entre os indivíduos aumenta o valor dos resultados experimentais, já que todos os animais respondem da mesma forma. Para obter ainda mais consistência, também podemos clonar ratos desde 1997.

Por outro lado, os ratos também são extremamente diversos, o que significa que os criadores comerciais podem selecionar características individuais para criar linhagens consanguíneas com características únicas. Por exemplo, o camundongo CBA tem uma baixa incidência de desenvolvimento de tumor mamário (câncer de mama), enquanto o camundongo nude BALB / c é imunodeficiente, pois não tem timo. Esses tipos de propriedades específicas da raça são úteis, pois permitem que os cientistas se concentrem em doenças específicas. Pesquisadores escolhem mdx camundongos, sem proteína muscular distrofina madura, como modelos para estudar distrofia muscular de Duchenne, enquanto outros escolhem camundongos diabéticos não obesos (ou NOD) como bons modelos para estudar novos tratamentos para autoimunidade (Wang et al. 2015).

Por que ratos? Modificação genômica

Além de estratégias de reprodução baseadas em variações naturais, os pesquisadores também têm uma série de ferramentas de modificação genética disponíveis. Como os camundongos compartilham aproximadamente 80 por cento de seus genes com os humanos, a modificação do DNA do camundongo é um método poderoso para a criação de modelos animais de doenças humanas. Técnicas como o Cre /salmão defumado O sistema e a ferramenta de edição de gene CRISPR mais recente permitem aos pesquisadores excluir, ativar ou reparar genes (Long, et al. 2016), recriando assim a doença humana no camundongo ou examinando o que acontece quando eles corrigem uma mutação.

Remover ou inativar um gene cria o que os cientistas chamam de camundongo “knock-out”. Alternativamente, eles podem criar animais transgênicos fazendo com que os camundongos expressem genes humanos ou carreguem células humanas - ou mesmo tecidos. Com técnicas como essas, os pesquisadores podem criar camundongos “humanizados” que respondem fisiologicamente quase como nós, permitindo que os pesquisadores vejam como a doença muda o corpo humano e como ele responde ao tratamento. Os pesquisadores realizam importantes trabalhos sobre a infecção pelo HIV e seu tratamento, utilizando camundongos com sistema imunológico humanizado (Schultz et al., 2012). Eles também testaram novas terapias que evitam que mães Rhesus negativas se tornem sensibilizadas ao fator Rhesus durante a gravidez, usando camundongos HOD que expressam uma proteína recombinante específica de glóbulos vermelhos (Bernardo et al., 2015).

Mesmo que existam diferenças importantes entre os genomas de camundongos e humanos, essas diferenças não são suficientes para descontar o valor dos camundongos para o estudo de doenças humanas. Embora os elementos regulatórios possam estar em lugares diferentes, embaralhados nos 75 milhões de anos desde que a evolução dos camundongos e humanos se separou, suas funções básicas são preservadas.

Sobre o mouse.

Os pesquisadores animais estão constantemente atentos aos três Rs:

  • Substituir: Existe um experimento alternativo que não precisa de animais?
  • Reduzir: Podemos ajustar o desenho experimental para usar menos animais?
  • Refinar: Podemos minimizar o impacto do experimento nos animais?

A pesquisa animal é rigidamente regulamentada no Canadá, com controles e supervisão rígidos para garantir o bem-estar e o tratamento ético. Esses regulamentos cobrem a habitação, o enriquecimento ambiental, o uso de medicamentos e anestesia e até a criação de camundongos geneticamente modificados. Os pesquisadores devem primeiro apresentar suas propostas experimentais aos comitês locais e federais para estabelecer um plano de cuidados com os animais e avaliar fatores como gravidade, desenho e valor científico antes de prosseguir com os estudos.

A penicilina, descoberta originalmente por Alexander Fleming em 1928, não apareceu como um tratamento médico que salvou vidas até o trabalho de Howard Florey, que testou sua segurança e eficácia em ratos dez anos depois. Sem ratos (e outros animais) em pesquisa, a medicina humana e animal ficaria sem penicilina, vacinas para poliomielite e meningite, terapia com anticorpos monoclonais, cura para leucemia promielocítica aguda e transferência de genes para fibrose cística.

Por que ratos? Insubstituível

Os cientistas estão sempre procurando alternativas ao uso de animais em pesquisas clínicas, mas o papel dos ratos como modelos experimentais para doenças humanas é, por enquanto, insubstituível. Mesmo com as diferenças entre as duas espécies, a realização de pesquisas básicas em modelos de doenças em camundongos humanizados fornece aos cientistas informações valiosas. Usar ratos como substitutos permite que os pesquisadores vejam primeiro como os pacientes podem responder ao tratamento antes de lhes dar a droga - um passo vital para garantir a segurança do paciente.

Canadian Blood Services - Impulsionando inovação de classe mundial

Por meio de descobertas, desenvolvimento e pesquisa aplicada, a Canadian Blood Services impulsiona a inovação de classe mundial em transfusão de sangue, terapia celular e transplante - trazendo clareza e visão para um futuro de saúde cada vez mais complexo. Nossa equipe de pesquisa dedicada e rede estendida de parceiros se envolvem em pesquisas exploratórias e aplicadas para criar novos conhecimentos, informar e aprimorar as melhores práticas, contribuir para o desenvolvimento de novos serviços e tecnologias e construir capacidade por meio de treinamento e colaboração.

Sobre o autor

Amanda Maxwell é redatora científica líder da Talk Science to Me, de Vancouver.


Desenvolvimento de anticorpos monoclonais de camundongo de alta qualidade para pesquisa em neurociência - abordagens, perspectivas e oportunidades

Anticorpos de alta qualidade (Abs) são essenciais para a pesquisa neurocientífica, pois permanecem o reagente proteômico de afinidade primário usado para marcar e capturar alvos proteicos expressos endogenamente no sistema nervoso. Como em outros campos, os neurocientistas são freqüentemente confrontados com resultados e / ou relatórios baseados em Ab imprecisos e irreproduzíveis. O UC Davis / NIH NeuroMab Facility foi criado com a missão de atender à necessidade não atendida de Abs de alta qualidade na pesquisa neurocientífica, aplicando uma abordagem única para gerar e validar anticorpos monoclonais de camundongo (mAbs) otimizados para uso contra o cérebro de mamíferos (ou seja, NeuroMabs ) Aqui, descrevemos nossa metodologia de triagem de mAb em várias etapas com foco na identificação de mAbs que exibem eficácia e especificidade na marcação de amostras de cérebro de mamíferos. Fornecemos exemplos de telas NeuroMab e da subsequente validação especializada daqueles selecionados como NeuroMabs. Destacamos os desafios particulares e as considerações de determinar a especificidade para a marcação imunológica do cérebro. Também descrevemos por que nossa ênfase na validação extensiva de um grande número de candidatos por imunoblotting e imuno-histoquímica contra amostras de cérebro é essencial para identificar aqueles que exibem eficácia e especificidade nessas aplicações para se tornarem NeuroMabs. Descrevemos a atenção especial dada aos candidatos com subclasses de IgG não-IgG1 menos comuns que podem facilitar a marcação multiplex simultânea com anticorpos secundários específicos da subclasse. We detail our recent use of recombinant cloning of NeuroMabs as a method to archive all NeuroMabs, to unambiguously define NeuroMabs at the DNA sequence level, and to re-engineer IgG1 NeuroMabs to less common IgG subclasses to facilitate their use in multiplex labeling. Finally, we provide suggestions to facilitate Ab development and use, as to design, execution and interpretation of Ab-based neuroscience experiments. Reproducibility in neuroscience research will improve with enhanced Ab validation, unambiguous identification of Abs used in published experiments, and end user proficiency in Ab-based assays.

Copyright © 2015 Elsevier B.V. All rights reserved.

Figuras

Figure 1. Representative ELISA primary screen data

Figure 1. Representative ELISA primary screen data

Scatter plots show the relative distribution of ELISA…

Figure 2. Representative immunoblot secondary screen data

Figure 2. Representative immunoblot secondary screen data

Images show immunoblot data from three different NeuroMab…

Figure 3. Representative images from IHC secondary…

Figure 3. Representative images from IHC secondary screens

Photomicrographs show DAB/NAS immunolabeling of sagittal sections…

Figure 4. Representative images from IF-ICC secondary…

Figure 4. Representative images from IF-ICC secondary screens

Photomicrographs show IF immunolabeling of COS-1 cells…

Figure 5. Tertiary screening by IB against…

Figure 5. Tertiary screening by IB against samples from human brain, and from KO mouse…


Crosslinkers with PEG spacers

Many kinds of Pierce Crosslinkers are available for protein, peptide and other macromolecular immobilization and conjugation needs. Both homobifunctional (identical reactive groups at either end) and heterobifunctional (different reactive groups at either end) crosslinkers are offered with a variety of spacer-arm lengths, solubility and cleaving characteristics.

The wide selection of crosslinking reagents now includes those that contain discrete-length polyethylene glycol spacers. These PEG groups increase reagent and conjugate solubility, minimize toxic and immunological effects compared to non-PEG spacers, and provide several options for accommodating specific crosslinking distances.

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Affinity-targeting schemes for protein biomarkers

Resumo

Proteomes may be composed of a million or more protein species. Finding and quantifying a single protein in samples of this complexity is a great challenge for liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) systems. This problem is complicated by the fact that proteomes bear proteoform families that vary slightly in primary, secondary, or tertiary structure and posttranslational modifications. Moreover, members of these families often vary in biological activity. The fact that many proteoforms are not in sequence libraries is a further problem. All of these variables complicate the interpretation of LC-MS data. A problem with LC-MS systems is that irrespective of their resolving power they lack the ability to select molecular species for analysis on a structural basis. It would be of great value to group polypeptides for analysis according to structural features instead of identifying those features after an analysis is completed. An analogy is that enormous physical dexterity is dwarfed in searching for needles in a hay stack by the use of a magnet to pull them out of the hay. The objective in this chapter is to describe technologies that select polypeptides and PTM-bearing variants from mixtures on the basis of their structure prior to or as a part of LC-MS analyses. Clearly, affinity selection methods will play a major role in the future of proteomics and clinical diagnostics.


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